客戶文章 ▏DAP-seq技術助力揭示水稻氮素吸收直接途徑和菌根途徑的新機制

2025年2月18日，南京農業大學徐國華、陳愛群教授團隊在PNAS期刊(IF=9.4)上發表了題為“OsNLP3 and OsPHR2 orchestrate direct and mycorrhizal pathways for nitrate uptake by regulating NAR2.1-NRT2s complexes in rice"的研究論文，該研究利用DAP-seq技術，系統的闡明了兩個轉錄因子OsNLP3和OsPHR2協同調控硝酸鹽轉運蛋白復合體NAR2.1-NRT2s介導的氮素吸收直接途徑和菌根途徑的分子機制。

研究背景

氮（N）是植物生長必需的營養元素，大多數陸地植物進化出了兩種氮吸收途徑：一種是直接通過根系吸收的途徑，另一種是通過與叢枝菌根（AM）真菌共生的途徑。然而，這兩種途徑在硝酸鹽吸收過程中的相互作用尚不明確。

研究結果

采用分區培養系統研究發現，水稻通過菌根吸收硝酸鹽的途徑比吸收銨更高效。葡糖醛酸酶（GUS）實驗顯示AM共生促進硝酸鹽吸收和同化，上調相關還原酶基因表達，且在含叢枝細胞中表達增強。

為了鑒定更多對水稻AM共生硝酸鹽吸收有重大貢獻的候選基因，作者通過qPCR分析，篩選出對硝酸鹽吸收具有關鍵作用的轉運基因：OsNRT2.1、OsNRT2.2和OsNRT2.3，以及編碼促進NRT2蛋白轉運到質膜的伴侶蛋白基因OsNAR2.1。葡糖醛酸酶（GUS）實驗顯示OsNAR2.1和OsNRT2s在菌根細胞中的表達顯著上調，這些基因在共生硝酸鹽吸收中起重要作用。

隨后，通過在osnar2.1敲除株系和野生型（WT）植株中研究發現，OsNAR2.1功能喪失導致非菌根化和菌根化根中OsNRT2.1/2.2/2.3的表達降低，說明OsNAR2.1介導的運輸系統對于收硝酸吸收的直接途徑和菌根途都是必需的。由于玉米ZmNAR2.1也顯示出 AM 誘導的表達模式，進一步研究發現玉米ZmNAR2.1也參與共生硝酸鹽吸收，這表明該途徑在禾本科物種中保守。

NLPs 被認為是硝酸鹽信號傳導中的主要轉錄因子，在陸地植物中廣泛保守，研究發現OsNLP3在調節硝酸鹽吸收直接和菌根途徑中起到關鍵作用。為了進一步研究OsNLP3轉錄因子對硝酸鹽吸收和代謝的調控機制，作者進行了酵母單雜交（Y1H）、電泳遷移率變動分析（EMSA）和染色質免疫共沉淀ChIP-qPCR分析，結果顯示OsNLP3能夠直接結合到OsNAR2.1啟動子的NRE-like1和NRE-like3基序上。熒光素酶報告基因分析結果顯示，OsNLP3激活OsNAR2.1啟動子。

OsNAR2.1、OsNRT2.1和OsNRT2.2的啟動子中至少有一個拷貝的PHR結合序列，因此推測，OsPHRs是否也可以調控硝酸鹽吸收。EMSA 、Y1H、熒光素酶報告實驗顯示，OsPHR1/2/3可以結合并激活OsNRT2.1、OsNRT2.1和OsNRT2.2的啟動子。osphr2突變體表現出降低的菌根共生效率和氮吸收能力，這說明OsPHR2正調控菌根硝酸鹽吸收途徑。

OsSPX4作為主要的細胞內磷傳感器，能夠通過與OsPHR2和OsNLP3相互作用，整合磷和硝酸鹽信號通路。為了確定OsSPX4是否能夠干擾OsPHR2或OsNLP3對OsNAR2.1的激活，作者在煙草葉片中進行了共轉化實驗，結果顯示OsSPX4 能夠顯著抑制OsPHR2或OsNLP3對LUC的激活。通過進一步對OsSPX4功能的研究發現，OsSPX4可能通過與OsPHR2和OsNLP3的相互作用來調控菌根共生硝酸鹽和磷酸鹽吸收途徑。

為了更深入地了解OsNLP3調控菌根共生和共生硝酸鹽吸收的機制，作者進行了DNA親和純化測序（DAP-seq），共鑒定出超過84,000個潛在的OsNLP3靶標區域，大約21%的結合位點位于啟動子區域。Motif富集分析發現，TGA(C)CCCT(C) 是OsNLP3結合位點顯著富集的基序。鑒于OsPHR2和OsNLP3共同調控共生硝酸鹽吸收，對OsNLP3和OsPHR2的潛在靶基因與在AM共生根中的差異表達基因（DEGs）進行了重疊分析。發現，在AM共生根中上調的1,122個基因同時也是OsNLP3和OsPHR2的共同靶基因。這些靶基因包括多個參與氮吸收和代謝的關鍵基因，例如NAR2.1、NRT2s、NPF4.5和NiR1。此外，一些在AM啟動和叢枝發育中起關鍵作用的基因也被鑒定為靶基因，例如SL生物合成基因D10和D17、脂質生物合成基因RAM2，FatM和DMI3。

通過在水稻原生質體中進行轉錄激活實驗，發現D17、NiR1、DMI3和OsRLI1的啟動子可以被OsNLP3和OsPHR2分別激活，從而證實了DAP-seq的結果。此外，除了RLI1在osnlp3菌根共生根中的表達水平與野生型菌根共生根相比沒有顯著變化外，其他選定基因在osnlp3和osphr2突變體的菌根共生根中表現出顯著下調。這些結果表明，OsPHR2和OsNLP3共同調控共生硝酸鹽吸收和AM共生途徑。

研究結論

該研究闡明了協調氮素吸收的直接途徑和菌根途徑的作用機制，*了菌根氮素營養的調控網絡，為進一步利用菌根途徑提高作物氮素利用效率提供了理論基礎和重要基因資源。