DAP-seq助力揭示蘋果MYB54轉錄因子調控細胞壁防御機制

2024年12月11日，西北農林科技大學馬鋒旺-李超團隊在The Plant Journal期刊（IF=6.2）發表了題為“MdMYB54 reduces disease severity caused by Fusarium solani in apple by modulating cell wall cellulose and pectate lyase-dependent defense"的研究論文，該文章借助DAP-seq技術，揭示了蘋果MYB54轉錄因子通過調節細胞壁纖維素和果膠裂解酶依賴的防御機制以減輕病害。

研究背景

蘋果是四大水果之一，但是蘋果種植面臨再植病 (ARD)問題，影響植株生長、果實品質和產量，這主要由尖孢鐮刀菌（Fusarium solani）引起。植物進化出復雜遺傳調控因子來抵抗生物和非生物脅迫，MYB 轉錄因子家族廣泛參與植物脅迫響應，但在蘋果抗F. solani中的作用及機制尚不清楚。植物細胞壁是抵御病原體入侵的第一道屏障，纖維素含量增加有助于增強植物抗病性，果膠裂解酶可觸發細胞壁防御反應，但 MYB 轉錄因子如何通過誘導細胞壁防御反應抵抗F. solani仍有待探索。

研究結果

前期研究結果表明，MdERF114通過調控MdPRX63的轉錄顯著增強了蘋果根部對尖孢鐮刀菌的抗性。作者通過Y2H（酵母雙雜交系統）篩到與MdERF114的互作蛋白MdMYB54，并通過pull-down、Y2H、熒光素酶互補（Split-LUC）實驗證實MdMYB54與MdERF114在體外和體內均直接相互作用。MdMYB54定位于細胞核，其啟動子中存在多個與脅迫和激素響應相關的順式作用元件。且受F. solani、水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）誘導，在蘋果根中高表達。

圖1 MdMYB54與MdERF114相互作用

為研究MdMYB54基因在蘋果根對F. solani的作用，作者構建了MdMYB54-OE和MdMYB54-RNAi材料。 MdMYB54-OE增強了蘋果根對F. solani的抗性，表現為植株生長受抑制程度減輕、根相對電導率（REL）和丙二醛（MDA）含量降低、根活性提高、根部病斑數量和面積減少；RNAi株系則表現出相反結果。

圖2 MdMYB54正向調控蘋果植株對Fusarium solani的抗性

使用DAP-seq技術檢測MYB54在全基因組水平上的結合位點。22%的結合位點位于基因啟動子區，36%位于遠端基因間區，10%位于基因下游區域，6%位于于外顯子區。通過Meme分析發現兩個高度富集的MdMYB54結合位點。DAP-qPCR結果顯示，MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的啟動子區與對照相比，富集倍數顯著增加。KEGG通路富集分析顯示，MdMYB54靶基因參在戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、MAPK信號通路、植物激素信號轉導和植物-病原體相互作用通路中顯著富集。GO分析發現，靶基因在乙烯、水楊酸和缺水響應等分子功能上顯著富集，說明MdMYB54可能與脅迫響應、植物生長發育有關。

圖3 MdMYB54靶基因的鑒定

電泳遷移率測定（EMSA）和酵母單雜交（Y1H）實驗結果顯示，MdMYB54在體內外直接與MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的啟動子結合。雙熒光素酶（Dual-Luc）和葡萄糖醛酸酶（GUS）實驗顯示，MdMYB54激活了這些基因的表達。

圖4 MdMYB54對MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的轉錄激活作用

在F. solani處理下，MdMYB54過表達根系纖維素含量和果膠裂解酶活性顯著高于野生型植株，而在MdMYB54-RNAi根系中則相反。

圖5 纖維素含量和果膠裂解酶活性的測定

為了進一步研究MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12在F. solani感染中的作用，作者構建了MdCesA6-OE，MdPLL8-OE，和MdPLL12-OE材料。發現過表達MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12增強了蘋果根對F. solani的抗性，表現為植株生長改善、根損傷減輕、REL和MDA含量降低、根活性提高。

圖6 MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12過表達增強了蘋果對F. solani的抗性

為研究MdERF114和MdMYB54的相互作用是否影響MdMYB54對MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的調控，作者進行了GUS、雙熒光素酶測定實驗。結果表明，MdERF114和MdMYB54之間的相互作用促進MdMYB54激活MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12啟動子的激活，增強蘋果對F. solani的抗性。

圖7 MdERF114促進了MdMYB54與MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12啟動子的結合

實驗結論

MdMYB54 是蘋果中抵抗F. solani的正調控因子，與MdERF114相互作用，通過直接結合并激活細胞壁相關基因MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的啟動子，增強纖維素沉積和果膠裂解酶活性，提高蘋果對F. solani的抗性。研究揭示了MdMYB54在F. solani感染蘋果根中的調控機制，為理解其在緩解蘋果再植病挑戰中的作用提供了依據，為提高蘋果產量和品質、培育優良砧木新品種奠定了理論基礎。