文獻(xiàn)題目：ONAC122 and ONAC131, controlled by OsSRWD1, OsRACK1A, and OsRGLG2, regulate rice immunity through modulating OsRFPH2-2 and OsBIERF3
發(fā)表期刊：New Phytologist
影響因子：8.1
物種：水稻
作者單位：浙江大學(xué)
發(fā)表時(shí)間：2026年2月24日
藍(lán)景科信提供：DAP-seq技術(shù)服務(wù)
主要研究結(jié)果
植物先天免疫系統(tǒng)是其抵御病原菌侵染的核心防線，主要包括病原/微生物/損傷相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫（PTI）和效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫（ETI）兩大層面。二者通過啟動(dòng)復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活NAC、WRKY、ERF等多個(gè)家族的轉(zhuǎn)錄因子（TFs），驅(qū)動(dòng)免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄重編程，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的抗性響應(yīng)。稻瘟病由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起，是水稻生產(chǎn)中破壞性的真菌病害之一，嚴(yán)重威脅全球糧食安全。解析水稻抗稻瘟病的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，挖掘關(guān)鍵抗病基因，是培育抗病水稻品種的核心基礎(chǔ)。
NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物的核心轉(zhuǎn)錄因子家族，其N端為保守DNA結(jié)合域，C端為轉(zhuǎn)錄調(diào)控可變域，在生長發(fā)育與逆境應(yīng)答中至關(guān)重要。水稻151個(gè)NAC成員中已有21個(gè)被證實(shí)參與免疫調(diào)控，其中ONAC122和ONAC131可正向調(diào)控稻瘟病抗性，但其作用機(jī)制、靶基因、上游調(diào)控及結(jié)合元件等關(guān)鍵科學(xué)問題仍未闡明。
該研究利用RNA-seq比較onac122、onac131突變體、過表達(dá)株系與野生型的轉(zhuǎn)錄組差異，GO與KEGG富集分析表明，相關(guān)差異表達(dá)基因主要富集在植物-病原菌互作、MAPK 信號(hào)通路等免疫相關(guān)通路。進(jìn)一步通過DAP-seq鑒定ONAC122全基因組結(jié)合位點(diǎn)，其中24.6%富集于基因啟動(dòng)子區(qū)，且其核心結(jié)合順式作用元件為經(jīng)典的CACG，同時(shí)鑒定出其可結(jié)合的新型ACTC元件。隨后通過酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ONAC122與ONAC131可形成同源及異源二聚體，ONAC131不直接激活靶基因，但可協(xié)同增強(qiáng)ONAC122對(duì)OsRFPH2-2和OsBIERF3的轉(zhuǎn)錄激活。而OsSRWD1和OsRACK1A作為互作蛋白，特異性增強(qiáng)ONAC122的轉(zhuǎn)錄活性，正向調(diào)控該模塊的免疫功能；而具有E3泛素連接酶活性的OsRGLG2，則通過泛素化修飾并經(jīng)26S蛋白酶體途徑降解ONAC122和ONAC131，抑制其功能，進(jìn)而負(fù)調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病的抗性。
該研究不僅為水稻抗稻瘟病的分子機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)，也為植物先天免疫系統(tǒng)的調(diào)控研究提供了新的視角，其研究成果兼具理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值，對(duì)保障水稻生產(chǎn)安全、推動(dòng)植物抗病分子育種發(fā)展具有重要意義。
圖1. ONAC122和ONAC131在水稻稻瘟病抗性及幾丁質(zhì)觸發(fā)的病原相關(guān)分子模式誘導(dǎo)免疫（PTI）中的正調(diào)控作用。（a~f）ONAC122（a~c）和ONAC131（d~f）正向調(diào)控水稻的稻瘟病抗性。采用打孔接種法，向onac122突變體、ONAC122過表達(dá)株系、onac131突變體、ONAC131過表達(dá)株系及ZH11的代表性葉片接種10 uL稻瘟病菌RB22菌株的孢子懸浮液（濃度為5×10?個(gè)?mL-1）后，觀察葉片的病害癥狀（a、d）、測定病斑長度（b、e）并檢測稻瘟病菌在植株體內(nèi)的相對(duì)生物量（c、f）。在接種后第5天記錄病害表型并采集葉片樣品（比例尺=0.2 cm）。采用熒光定量PCR法對(duì)病菌相對(duì)生物量進(jìn)行定量分析，以稻瘟病菌MoPot2基因的表達(dá)量相對(duì)于水稻泛素基因OsUbi的表達(dá)量的倍數(shù)表示。圖b、c、e、f中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，其中b、e的樣本量n=27，c、f的樣本量n=9。（g、h）幾丁質(zhì)處理后，onac122突變體、ONAC122過表達(dá)株系（g）以及onac131突變體、ONAC131過表達(dá)株系（h）中的活性氧（ROS）爆發(fā)情況。（i、j）幾丁質(zhì)處理后，onac122突變體、ONAC122過表達(dá)株系（i）以及onac131突變體、ONAC131過表達(dá)株系（j）和ZH11植株中OsWRKY45基因的表達(dá)變化。將水稻葉圓片在水中過夜預(yù)培養(yǎng)后，用濃度為100ug?mL-1的幾丁質(zhì)處理，以清水處理作為陰性對(duì)照；立即檢測化學(xué)發(fā)光信號(hào)，以相對(duì)光單位（RLU）表示檢測結(jié)果（g、h）。在處理后指定時(shí)間點(diǎn)采集葉片樣品，進(jìn)行基因表達(dá)分析，以水稻18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理（i、j）。圖g、h中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，樣本量n=3；圖i、j中樣本量n=9。注：b、c、e、f中**表示與ZH11相比，差異極顯著（P<0.01，Student's t檢驗(yàn)）；i、j中不同字母表示組間差異顯著（P<0.05，單因素方差分析）。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果一致。
圖2. 轉(zhuǎn)錄組測序分析水稻onac122突變體、ONAC122過表達(dá)株系、onac131突變體及ONAC131過表達(dá)株系中的差異表達(dá)基因。（a）韋恩圖展示未接稻瘟病菌時(shí)，與ZH11相比，在onac122和onac131突變體中下調(diào)、且在ONAC122和ONAC131過表達(dá)株系中上調(diào)的差異表達(dá)基因分布情況。（b、c）與ZH11相比，ONAC122和ONAC131過表達(dá)株系中上調(diào)基因（b）、onac122和onac131突變體中下調(diào)基因（c）的GO功能富集分析結(jié)果。（d、e）與ZH11相比，ONAC122和ONAC131過表達(dá)株系（d）、onac122和onac131突變體（e）中免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化。（f、g）經(jīng)稻瘟病菌接種或未接種處理后，onac122突變體、ONAC122過表達(dá)株系（f），以及onac131突變體、ONAC131過表達(dá)株系（g）和ZH11中篩選出的免疫相關(guān)基因的表達(dá)模式。對(duì)三周齡水稻植株采用葉面噴霧法接種稻瘟病菌RB22菌株的孢子懸浮液（濃度為2×10?個(gè)?mL-1），并以0.05%的吐溫-20噴霧處理作為空白對(duì)照；在接種后指定時(shí)間點(diǎn)采集葉片樣品進(jìn)行基因表達(dá)分析，以水稻18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。圖f、g中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，樣本量n=3；不同字母表示組間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05，單因素方差分析）。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
圖3. 水稻ONAC122的全基因組結(jié)合位點(diǎn)及ONAC122、ONAC131對(duì)CACG和ACTC順式作用元件的結(jié)合活性。（a）經(jīng)DAP-seq分析得到的兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)中，ONAC122高可信度結(jié)合峰的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。（b）DAP-seq分析鑒定的ONAC122結(jié)合峰在基因區(qū)域及染色體其他區(qū)域的分布情況。（c）兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)的DAP-seq分析中，ONAC122在基因啟動(dòng)子區(qū)的高可信度結(jié)合峰統(tǒng)計(jì)結(jié)果。（d、e）被鑒定為ONAC122結(jié)合序列的CACG元件（d）和ACTC元件（e）。（f~i）電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（EMSA）中，ONAC122、ONAC131對(duì)CACG元件（f、g）、ACTC元件（h、i）及其突變體的結(jié)合活性。將Bio標(biāo)記的探針，與GST-ONAC122蛋白、GST-ONAC131蛋白或純化的GST蛋白（作為陰性對(duì)照）共孵育，設(shè)置添加或不添加過量（20倍）非標(biāo)記探針的實(shí)驗(yàn)組。特異性DNA-蛋白復(fù)合物與游離探針均用黑色箭頭標(biāo)注。（j）酵母單雜交實(shí)驗(yàn)（Y1H）中，ONAC122、ONAC131對(duì)CACG順式作用元件的結(jié)合活性。將轉(zhuǎn)入指定Rec2載體與pHis2載體組合的酵母細(xì)胞，經(jīng)梯度稀釋后，分別培養(yǎng)在SD/缺Trp/缺Leu、SD/缺Trp/缺Leu/缺His+30mmol/L3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）、SD/缺Trp/缺Leu/缺His+50mmol/L3-AT培養(yǎng)基上。（k）ACTC識(shí)別序列無法與CACG識(shí)別序列競爭結(jié)合ONAC122。將Bio標(biāo)記的3×CACG探針，與GST-ONAC122蛋白或純化的GST蛋白（作為陰性對(duì)照）共孵育，設(shè)置添加或不添加過量（20倍）非標(biāo)記3×ACTC探針的實(shí)驗(yàn)組。特異性DNA-蛋白復(fù)合物與游離探針均用黑色箭頭標(biāo)注。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
圖4. 水稻ONAC122對(duì)OsRFPH2-2和OsBIERF3啟動(dòng)子的結(jié)合活性及其對(duì)二者的轉(zhuǎn)錄激活作用。（a） 稻瘟病菌接種與未接種條件下，onac122突變體和ONAC122過表達(dá)株系中OsRLCK107、OsRFPH2-2和OsBIERF3 基因的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)三周齡水稻植株采用葉面噴霧法，接種稻瘟病菌RB22菌株的孢子懸浮液（濃度為2×10?個(gè)?mL-1），并以0.05%吐溫-20噴霧處理作為空白對(duì)照；在接種后指定時(shí)間點(diǎn)采集葉片樣品進(jìn)行基因表達(dá)分析，以水稻18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參完成數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，樣本量n=9。（b、c）電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ONAC122與OsRFPH2-2啟動(dòng)子S2位點(diǎn)（b）、OsBIERF3啟動(dòng)子S2/S3位點(diǎn)（c）中CACG順式作用元件的結(jié)合作用。圖中CACG元件以紅色字體標(biāo)注并添加下劃線，（+）表示正鏈，（-）表示負(fù)鏈。將含CACG順式作用元件的30bp片段及其突變體片段進(jìn)行Bio標(biāo)記，與GST-ONAC122蛋白共孵育，同時(shí)設(shè)置添加/不添加20倍過量非標(biāo)記探針的實(shí)驗(yàn)組，以純化的GST蛋白作為陰性對(duì)照。特異性DNA-蛋白復(fù)合物與游離探針均用黑色箭頭標(biāo)注。（d）經(jīng)DAP-seq鑒定的OsRFPH2-2和OsBIERF3啟動(dòng)子中潛在的CACG順式作用元件位點(diǎn)。其中P1和P2為ChIP-PCR所用探針，S1、S2、S3為啟動(dòng)子區(qū)域的CACG順式作用元件位點(diǎn)。（e）ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ONAC122在體內(nèi)與OsRFPH2-2和OsBIERF3啟動(dòng)子片段的結(jié)合作用。提取ONAC122-GFP融合蛋白表達(dá)株系的染色質(zhì)片段化DNA，與GFP抗體（α-GFP）共孵育，以免疫前血清（Pre）作為陰性對(duì)照；將免疫沉淀（IP）樣品、免疫沉淀前的染色質(zhì)DNA（陽性對(duì)照/輸入樣品）用于PCR擴(kuò)增檢測。（f）雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中所用的ONAC122、ONAC131效應(yīng)載體及靶基因啟動(dòng)子報(bào)告載體示意圖。（g、h）本氏煙草葉片中瞬時(shí)共表達(dá)ONAC122和/或ONAC131與OsRFPH2-2（g）、OsBIERF3（h）啟動(dòng)子后的相對(duì)熒光素酶/海腎熒光素酶（LUC/Ren）活性值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，樣本量n=6。（i）ONAC131可提高ONAC122對(duì)含CACG元件的OsRFPH2-2和OsBIERF3啟動(dòng)子片段的結(jié)合親和力。將Bio標(biāo)記的探針與重組GST-ONAC122蛋白單獨(dú)孵育，或與GST-ONAC122和GST-ONAC131蛋白共同孵育；特異性DNA-蛋白復(fù)合物與游離探針用黑色箭頭標(biāo)注，蛋白相對(duì)表達(dá)量采用IMAGEJ軟件進(jìn)行定量分析。注：a、g、h中不同字母表示組間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05，單因素方差分析）；所有實(shí)驗(yàn)均至少獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果一致。
圖5. OsRFPH2-2 在水稻稻瘟病抗性及幾丁質(zhì)觸發(fā)的模式觸發(fā)免疫（PTI）中的正調(diào)控作用。（a）OsRFPH2-2的E3泛素連接酶活性檢測。將GST融合OsRFPH2-2蛋白與人類E1、E2泛素結(jié)合酶及FLAG標(biāo)簽泛素在30℃條件下共孵育3小時(shí)，采用抗GST抗體和抗FLAG抗體分別檢測蛋白泛素化修飾水平與蛋白表達(dá)量。（b~d）OsRFPH2-2基因敲除突變體的稻瘟病抗性顯著降低。采用打孔接種法，向代表性的osrfph2-2突變體和ZH11葉片接種10 uL稻瘟病菌RB22菌株的孢子懸浮液（濃度為5×10?個(gè)?mL-1），觀察葉片的病害癥狀（b）、測定病斑長度（c）并檢測病菌在植株體內(nèi)的相對(duì)生物量（d）。在接種后第5天記錄病害表型并采集葉片樣品，比例尺為0.2 cm。采用熒光定量PCR法檢測病菌相對(duì)生物量，以稻瘟病菌MoPot2基因表達(dá)量相對(duì)于水稻泛素基因OsUbi的倍數(shù)表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，其中c的樣本量n=27，d的樣本量n=9。（e）稻瘟病菌接種與未接種條件下，osrfph2-2突變體和ZH11中抗病相關(guān)基因的表達(dá)變化。對(duì)三周齡水稻植株采用葉面噴霧法接種稻瘟病菌RB22菌株的孢子懸浮液（濃度為2×10?個(gè)?mL-1），并以等體積0.05%吐溫-20溶液噴霧處理作為陰性對(duì)照；在接種后48小時(shí)采集葉片樣品進(jìn)行基因表達(dá)分析，以水稻18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參完成數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，樣本量n=9。（f、g）osrfph2-2突變體和ZH11中幾丁質(zhì)觸發(fā)的活性氧（ROS）爆發(fā)情況（f）及OsWRKY45基因的表達(dá)變化（g）。將水稻葉圓片在清水中過夜預(yù)培養(yǎng)后，用濃度為100 ug?mL-1的幾丁質(zhì)處理，以清水處理作為陰性對(duì)照；立即檢測化學(xué)發(fā)光信號(hào)，結(jié)果以相對(duì)光單位（RLU）表示（f）。在處理后指定時(shí)間點(diǎn)采集葉片樣品進(jìn)行基因表達(dá)分析，以水稻18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參完成數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化（g）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，其中f的樣本量n=3，g的樣本量n=9。注：c、d中**表示與ZH11相比差異極顯著（P<0.01，Student's t檢驗(yàn)）；e、g中不同字母表示組間差異顯著（P<0.05，單因素方差分析）。所有實(shí)驗(yàn)均至少獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果一致。
圖6. 水稻 ONAC122、ONAC131 與 OsSRWD1、OsRACK1A 及 OsRGLG2 的蛋白互作關(guān)系。（a）酵母雙雜交（Y2H）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ONAC122、ONAC131與OsSRWD1、OsRACK1A、OsRGLG2的互作。將含有指定重組pGBKT7載體與pGADT7載體組合的酵母菌株，分別培養(yǎng)在SD/缺Trp/缺Leu培養(yǎng)基或SD/缺Trp/缺Leu/缺His/缺腺嘌呤/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-α-gal）/金擔(dān)子素A（AbA）培養(yǎng)基上，根據(jù)酵母菌落的生長情況判斷蛋白間是否存在互作。（b）免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ONAC122、ONAC131與OsSRWD1、OsRACK1A、OsRGLG2的互作。將攜帶重組pCAMBIA1300-GFP載體、pFGC1008-HA載體或空pCAMBIA1300-GFP載體的農(nóng)桿菌，按指定組合共浸潤至本氏煙草葉片中；浸潤后48小時(shí)提取總蛋白，用GFP親和磁珠進(jìn)行3小時(shí)免疫沉淀，隨后分別采用抗GFP抗體和抗HA抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，目標(biāo)蛋白用紅色星號(hào)標(biāo)注。（c）雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ONAC122、ONAC131與OsSRWD1、OsRACK1A、OsRGLG2的互作。將攜帶重組或空p2YN載體與p2YC載體的農(nóng)桿菌，分別共浸潤至表達(dá)核定位標(biāo)記蛋白R(shí)FP-H2B的本氏煙草葉片中；浸潤后48小時(shí)觀察熒光信號(hào)，比例尺為20 um。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果一致。
圖7. OsSRWD1、OsRACK1A及OsRGLG2對(duì)ONAC122轉(zhuǎn)錄活性的影響，以及 OsRGLG2 在水稻稻瘟病抗性和幾丁質(zhì)觸發(fā)的模式觸發(fā)免疫（PTI）中的負(fù)調(diào)控作用。（a~c）在OsRFPH2-2啟動(dòng)子存在的條件下，本氏煙草葉片中瞬時(shí)共表達(dá)ONAC122、ONAC131與OsSRWD1（a）、OsRACK1A（b）或OsRGLG2（c）后的相對(duì)熒光素酶/海腎熒光素酶（LUC/Ren）活性值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，樣本量n=6。（d~f）OsRGLG2基因敲除突變體（osrglg2）的稻瘟病抗性顯著增強(qiáng)。采用打孔接種法，向代表性的osrglg2突變體和ZH11葉片接種10 uL稻瘟病菌RB22菌株的孢子懸浮液（濃度為5×10?個(gè)?mL-1），觀察葉片的病害癥狀（d）、測定病斑長度（e）并檢測病菌在植株體內(nèi)的相對(duì)生物量（f）。在接種后第5天記錄病害表型并采集葉片樣品，比例尺為0.2 cm。采用熒光定量PCR法檢測病菌相對(duì)生物量，以稻瘟病菌MoPot2基因表達(dá)量相對(duì)于水稻泛素基因OsUbi的倍數(shù)表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，其中e的樣本量n=27，f的樣本量n=9。（g）稻瘟病菌接種與未接種條件下，osrglg2突變體和ZH11中OsPBZ1基因的表達(dá)變化。對(duì)三周齡水稻植株采用葉面噴霧法接種稻瘟病菌RB22菌株的孢子懸浮液（濃度為2×10?個(gè)?mL-1），并以等體積0.05%吐溫-20噴霧處理作為陰性對(duì)照；在接種后48小時(shí)采集葉片樣品進(jìn)行基因表達(dá)分析，以水稻18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參完成數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，樣本量n=9。（h、i）osrglg2突變體和ZH11中幾丁質(zhì)觸發(fā)的活性氧（ROS）爆發(fā)情況（h）及OsWRKY45基因的表達(dá)變化（i）。將水稻葉圓片在清水中過夜預(yù)培養(yǎng)后，用濃度為100 μg?mL-1的幾丁質(zhì)處理，以清水處理作為陰性對(duì)照；立即檢測化學(xué)發(fā)光信號(hào)，結(jié)果以相對(duì)光單位（RLU）表示（h）。在處理后指定時(shí)間點(diǎn)采集葉片樣品進(jìn)行基因表達(dá)分析，以水稻18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參完成數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化（i）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，其中h的樣本量n=3，i的樣本量n=9。注：a~c、g、i中不同字母表示組間差異顯著（P<0.05，單因素方差分析）；e、f中**表示與ZH11相比差異極顯著（P<0.01，Student'st檢驗(yàn)）。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果一致。
圖8. 水稻中OsRGLG2介導(dǎo)的ONAC122和ONAC131泛素化修飾與降解。（a）OsRGLG2的E3泛素連接酶活性及體外對(duì)ONAC122、ONAC131的泛素化修飾。將OsRGLG2-HIS與GST-ONAC122或GST-ONAC131，在人類E1、E2泛素結(jié)合酶及FLAG標(biāo)簽泛素存在的條件下，于30℃共孵育3小時(shí)。采用抗HIS抗體、抗GST抗體及抗FLAG抗體分別檢測蛋白泛素化修飾水平與蛋白表達(dá)量。（b）本氏煙草葉片中OsRGLG2對(duì)ONAC122、ONAC131的泛素化修飾。將攜帶指定重組載體（pCAMBIA1300-OsRGLG2-GFP、pFGC1008-ONAC122-HA、pFGC1008-ONAC131-HA）或空載體（pCAMBIA1300-GFP、pFGC1008-HA）的農(nóng)桿菌共浸潤至本氏煙草葉片；浸潤后48小時(shí)提取總蛋白，用GFP親和磁珠免疫沉淀3小時(shí)，隨后采用抗HA抗體、抗GFP抗體及抗泛素抗體進(jìn)行免疫印跡檢測。（c、d）無細(xì)胞降解實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OsRGLG2介導(dǎo)的GST-ONAC122（c）和GST-ONAC131（d）降解。將GST-ONAC122、GST-ONAC131分別與OsRGLG2基因敲除突變體（osrglg2）和ZH11的總蛋白提取物共孵育，設(shè)置添加或不添加50μM蛋白酶體抑制劑MG132的實(shí)驗(yàn)組，通過抗GST抗體免疫印跡檢測目標(biāo)蛋白的降解情況。（e、f）本氏煙草葉片中OsRGLG2介導(dǎo)的ONAC122（e）和ONAC131（f）降解。將攜帶指定重組載體（pCAMBIA1300-OsRGLG2-GFP、pFGC1008-ONAC122-HA、pFGC1008-ONAC131-HA）的農(nóng)桿菌共浸潤至本氏煙草葉片，在浸潤后24小時(shí)添加或不添加50μMMG132；提取總蛋白后，采用抗GFP抗體、抗HA抗體及抗Actin抗體進(jìn)行免疫印跡檢測。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果一致。
圖9. osrglg2 onac122 雙突變體稻瘟病抗性減弱及OsRGLG2-ONAC122/131-OsRFPH2-2調(diào)控水稻免疫的模式圖。（a~c）osrglg2onac122雙突變體的稻瘟病抗性顯著減弱。采用打孔接種法，向代表性的onac122單突變體、osrglg2單突變體、osrglg2onac122雙突變體及ZH11葉片接種10uL稻瘟病菌RB22菌株的孢子懸浮液（濃度為5×10?個(gè)?mL-1），觀察葉片的病害癥狀（a）、測定病斑長度（b）并檢測病菌在植株體內(nèi)的相對(duì)生物量（c）。在接種后第5天記錄病害表型并采集葉片樣品，比例尺為0.2厘米。采用熒光定量PCR法檢測病菌相對(duì)生物量，以稻瘟病菌MoPot2基因表達(dá)量相對(duì)于水稻泛素基因OsUbi的倍數(shù)表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，其中b的樣本量n=27，c的樣本量n=9。b、c中不同字母表示組間差異顯著（P<0.05，單因素方差分析）。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果一致。（d）OsRGLG2-ONAC122/131-OsRFPH2-2調(diào)控水稻免疫的模式圖。NAC轉(zhuǎn)錄因子ONAC122可通過轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因（包括OsRFPH2-2和OsBIERF3）的表達(dá)，正向調(diào)控水稻免疫；ONAC131可協(xié)同增強(qiáng)ONAC122介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用。ONAC122和ONAC131均能與OsSRWD1、OsRACK1A及OsRGLG2發(fā)生互作，其中OsSRWD1和OsRACK1A可增強(qiáng)ONAC122的轉(zhuǎn)錄活性，而OsRGLG2則抑制其轉(zhuǎn)錄活性。具有活性的E3泛素連接酶OsRGLG2可通過泛素化修飾ONAC122和ONAC131并促進(jìn)二者降解，進(jìn)而抑制水稻免疫。圖中“促進(jìn)作用"以箭頭表示，代表激活或上調(diào)；“抑制作用"以鈍端箭頭表示，代表抑制或下調(diào)。該模式圖通過BioRender軟件繪制。
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